FCSalyzer是一个免费的流式细胞仪数据分析程序,它是用java编程的,因此它可以在许多不同的操作系统上工作。FCSalyzer提供了简单的‘所见即所得’界面和标准的分析工具——位图、直方图、复杂的门控策略和相关的统计数据。
[软件功能] 1。单一标准样品。
单参数直方图通常用于显示单标记样本数据。通常,横坐标可以是线性标度或对数标度,表示检测到的荧光或散射光的强度;纵坐标表示横坐标上具有特定荧光强度的细胞数量,有时用相对百分比表示。
使用3色comp文件夹中的CyPE comp.fcs进行分析和演示。将此文件夹移动到桌面,并将数据文件夹从桌面拖到Flowjo中的组空间。
单击并选择组空间中的“3色comp”组,“3色comp”组中的所有样本将显示在样本空间中。然后,双击样本空间中的“cy5peccomp.fcs”以显示图形窗口。
这是一个二维点图,在X轴上选择了SSC(横向散射)。细胞内粒子结构越复杂,质量越大,SSC越大,反之亦然。y轴选择FSC(前向散射,单元越大,FSC越大;相反,越小。)
选择任意一种门设置工具(矩形门、椭圆形门、多边形门和自动门),在2D点图中选择淋巴细胞。
双击图形窗口中选定的淋巴细胞,生成新的图形窗口。x轴选择Cy5PE:CD4,y轴选择直方图,选择任意一个门设置工具(区域门和双门),在单参数直方图中设置门。
2.多色样品。
多色样品,包括双标记、三标记及以上的样品。横坐标和纵坐标分别代表与细胞相关的两个独立参数,平面上的每个点代表具有相应坐标值的细胞。
以三标样品为例,选择931115-B02-Sample01。FCS在三色实验文件夹中进行分析和演示。同样,双击“931115-B02-Sample01。FCS”示例,将出现一个图形窗口,显示为2D点图。选择FSC作为x轴,选择SSC作为y轴。然后选择多边形门工具,并在2D点地图中选择淋巴细胞。
双击淋巴细胞门,会出现一个图形窗口。X轴选择荧光:CD3,Y轴选择FSC。用矩形门工具选择CD3阳性细胞,命名为T细胞。
双击T细胞门,会出现一个图形窗口。在X轴上选择CY5PE:3360CD 4,在Y轴上选择PHYERY :3360CD 8,用十字门工具设置门(拖动鼠标将象限移动到目标位置。一般根据细胞分组的趋势,象限分割线可以设置在阴性和阳性细胞的分组处),如下图所示:
Q1: CD8单阳性细胞,CD8 T细胞。
Q2:双阳性细胞。
Q3: CD4单阳性细胞,为CD4 T细胞。
Q4:双阴性细胞。
3.细胞凋亡。
拖动凋亡样本,双击原始数据,打开图形窗口。选择FSC-A作为x轴,选择SSC-A作为y轴。凋亡细胞的分析选择上面显示的细胞群进行分析。细胞碎片不会被分析。
双击SSC/FSC图中的“分析细胞群”,选择X轴上的FITC,用于表示annexiv-FITC。y轴选择PE-Texas,用于表示PI。活细胞和凋亡细胞由四门工具定义。如下图所示:
Q1: (annexnv-FITC)-/pi,这个区域的细胞是坏死细胞。可能有少量晚期凋亡细胞,甚至是机械损伤的细胞。
q 2:(annexiv FITC)/PI PI,该区域细胞为晚期凋亡细胞。
Q3:(Q3:(annexiv-FITC)/PI-PI-,该区域细胞为早期凋亡细胞。
Q4: (annexnv-FITC)-/pi-,这个区域的细胞是活细胞。
通常,Q2 Q3、晚期凋亡早期凋亡组(即所有AnnexinV阳性组)用于计数凋亡率。
4.细胞周期。
细胞周期检测是流式细胞术最广泛的应用之一。细胞周期是指由有丝分裂增殖的细胞从亲本分裂结束到子代分裂结束的过程。它通常由G1、S、G2和M相组成。为保证DNA复制的准确性,细胞应在G1期完成必要的生长和物质准备,在S期完成染色体DNA复制,在G2期进行必要的检查和修复。在M期完成对子细胞的等分配遗传,使细胞分裂。
PI最常用于细胞周期检测。PI是一种嵌入核酸的荧光染料,可以选择性地嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间,其结合量与DNA的含量成正比。通过流式细胞仪分析,可以得到细胞周期各阶段的DNA分布,并计算出各阶段的百分比含量。
以细胞周期文件夹中的5206.001,PI标记为例,通过设置门选择目标细胞群,排除细胞碎片。也就是双击工作台中的5206.001样本打开图形窗口。选择x轴上的FSC-H和y轴上的SSC-H。细胞碎片位于左下角。通过设置门来选择目标单元格,如下图所示:
选择要分析细胞周期的单细胞群体,排除粘附细胞(双细胞或粘附在一起的多细胞团等)的影响。).选择FL2-W(宽度)作为x轴,FL2-A(面积)作为y轴。门设置模式如下:
BD流量计采集的数据:在周期分析中,通常采用FL2-A和FL2-W(或FL2-A和FL2H)来设定闸门。
贝克曼流量计采集的数据:X轴选用FL3-LIN表示PI的线性信号。y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。按下图设置门:
在FlowJo工作台中选择节点“单细胞群体”,在菜单栏的“工具”中选择“细胞周期”,打开周期分析窗口。获得了G1、S、G2细胞的百分比、G1的变异系数和G2的变异系数。
图中粉色曲线为周期拟合的模型曲线,黑色曲线为样本曲线。理想情况下,粉色和黑色曲线最好保持一致。拟合的好坏可以根据右边的均方根值来判断。均方根误差值越小越好。当周期拟合不好时,可以通过改变拟合模型(沃森和迪恩-杰特-福克斯)或改变限制条件(G1是G2的两倍大)来调整。
【功能介绍】分析FCS2和FCS3列表模式文件。
你看到的就是你得到的——故事被放在一个分页的文档上。
位图、密度图和直方图-都有覆盖。
图纸可以用它们的统计数据复制。
【软件亮点】阶梯式门。
图像呈现方法
设置门的各种工具。
强大的批处理功能。
多种分析平台和工具。
荧光补偿
灵活的数据导出。